大黄素抑制人肝癌HepG2细胞血管生成作用及其机制研究

摘要：目的 大黄素可促进人肝癌HepG2细胞的凋亡,然而其是否可抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)血管生成及其机制罕见报道.本研究探讨大黄素对人肝癌HepG2细胞血管生成以及缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1a,HIF-1d)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响,以及大黄素体内抗肝癌机制.方法 采用体内鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验,实验随机分为阴性对照组(生理盐水)、大黄素低剂量组(10 μmol/L)、大黄素高剂量(20 μmol/L)和阳性对照组(0.15 mg/mL地塞米松),每组各10只,每24 h每组追加同样等量药物,共72 h,观察大黄素对CAM血管生成的抑制作用.体外培养HepG2细胞,以氯化钴(CoCl2)模拟化学缺氧,设立缺氧未处理组[阴性对照组(生理盐水)]、缺氧大黄素低剂量组(10 μmol/L)、缺氧大黄素高剂量组(20 μmol/L)和缺氧阳性对照组[10 μmol/L 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)],每组设6个复孔,处理24 h.采用小管形成实验,观察大黄素对HepG2细胞相对小管数目的影响,免疫细胞化学分析检测HIF-1α和VEGF阳性细胞的表达,Real-Time PCR分析检测HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达.采用Graphpad 5.0软件进行描述性统计,组间比较采用one-way-ANOWA和Bonferroni检验.结果 CAM实验显示,实验组新生血管数目明显减少,与阴性照组比较,差异有统计学意义,F=13.374,P=0.002.阴性对照组新生血管数目为(31.47±1.81)个.给药后CAM血管生成减少,大黄素低剂量组、高剂量组和地塞米松组分别为(19.48±0.66)、(10.33±1.04)和(9.89±0.57)个,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,P值分别为0.041、0.004和0.003;大黄素低剂量组和高剂量组与地塞米松组比较,差异无统计学意义,P值分别为0.539和1.000.小管形成实验显示,实验组相对小管数目明显减少,与阴性照组比较,差异有统计学意义,F=21.529,P＜0.001.阴性对照组相对小管数目为(100.00±0.00)％.给药后,相对小管数目明显减少,大黄素低剂量、高剂量组和阳性对照组分别为(65.85±12.67)％、(46.94±8.34)％和(41.77±7.53)％,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,P值分别为0.049、0.001和＜0.001;大黄素低剂量组和高级剂量组与阳性对照组比较,差异无统计学意义,P值分别为0.104和0.069.免疫细胞化学分析显示,大黄素低剂量组、高剂量组和阳性对照组HIF-1α和VEGF阳性细胞显著减少.Real-Time PCR分析显示,实验组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达降低,与阴性照组比较,差异有统计学意义(F=31.908,P＜0.001;F=25.146,P＜0.001).阴性对照组HepG2细胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达分别为0.92±0.15和0.95±0.15;大黄素低剂量组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达分别为0.45±0.07和0.51±0.08,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,P值分别为0.021和0.013;大黄素高剂量组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达分别为0.32±0.05和0.40±0.07,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,P值分别为＜0.001和0.001;阳性对照组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达分别为0.30±0.04和0.34±0.05,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,P值均＜0.001;大黄素低剂量组、高剂量组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达与阳性对照组比较,差异无统计学意义,P值分别为0.663、0.362、0.443和1.000.结论 大黄素可能通过抑制HIF-1d mRNA的表达,从而降低VEGF mRNA的表达来抑制HepG2细胞新生血管的形成.