siRNA沉默hDOT1L基因表达对人THP-1细胞增殖活性作用机制研究

摘要：目的 调节蛋白混合性白血病(regulatory protein mixed lineage leukaemia,MLL)是常见的复发/难治性急性白血病,目前仍无标准有效的治疗方案,急需研发新的靶向药物.本研究旨在检测小干扰RNA(siRNA)沉默人类组蛋白赖氨酸甲基转移酶hDOT1L基因表达对人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖的影响,探讨hDOT1L基因在白血病发病中的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将hDOT1L siRNA转染体外培养的THP-1细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测hDOT1L siRNA单独或与地西他滨(Decitabine)联合应用对THP-1细胞增殖的影响.采用RT-PCR法检测THP-1细胞hDOT1L、HOXA9、HOXA10和MLL-AF10(MLLT10)mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测THP-1细胞H3K79甲基化水平、hDOT1L蛋白表达水平及PI3K/AKT通路中关键分子表达变化.结果 MTT结果显示,与对照组相比(0.17±0.02),hDOT1L siRNA单独(0.56±0.04)或与地西他滨联合应用(0.66±0.06)48 h后可明显抑制THP-1细胞增殖,F=284.225,P<0.001.RT-PCR结果表明,THP-1细胞的HOXA9、HOXA10、MLLT10和hDOT1L mRNA表达水平在hDOT1L siRNA组分别为0.34±0.06、0.27±0.06、0.32±0.08和0.26±0.07;在hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.15±0.06、0.14±0.05、0.16±0.06和0.13±0.06;与对照组(0.92±0.18、0.77±0.13、0.79±0.13和0.68±0.14)比较明显下降,差异有统计学意义,均P<0.001.蛋白质印迹法检测mono-H3K79、di-H3K79、tri-H3K79蛋白表达水平在对照组分别为0.54±0.06、0.58±0.09和0.75±0.05,hDOT1L siRNA组分别为0.44±0.02、0.31±0.06、0.41±0.09,hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.38±0.08、0.21±0.03、0.27±0.04,均较对照组明显降低,均P<0.001;Control siRNA组细胞内T-AKT、p-AKT、PI3K及hDOT1L蛋白表达水平分别为0.70±0.15、0.71±0.13、0.49±0.14、0.72±0.05,hDOT1L siRNA组分别为0.64±0.12、0.51±0.04、0.30±0.04和0.36±0.04,hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.65±0.05、0.31±0.09、0.22±0.04和0.24±0.04,后两组与Control siRNA组相比,细胞内p-AKT、PI3K及hDOT1L蛋白表达水平明显下降,差异均有统计学意义,P<0.001;而总AKT(T-AKT)蛋白表达水平在各组间比较差异均无统计学意义,F=0.667,P=0.578.结论 hDOT1L基因可能通过增加白血病细胞H3K79基因甲基化水平,诱导MLL相关基因及PI3K/AKT通路中关键分子的表达,促进白血病细胞增殖而参与白血病发病机制.hDOT1L有望成为治疗白血病的新靶标,hDOT1L抑制剂与地西他滨联合应用有望进一步提高白血病治疗疗效.